Как повлияют на активность ферментов ионы тяжелых металлов

В ряде случаев ионы металлов (Со2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+) выполняют функции простетических групп ферментов, или служат акцепторами и донаторами электронов. В других случаях они способствуют присоединению субстрата к активному центру и образованию фермент-субстратного комплекса.

Например, ионы Mg2+ через отрицательно заряженную фосфатную группу обеспечивают присоединение монофосфатных эфиров органических веществ к активному центру фосфатаз, катализирующих гидролиз этих соединений. Иногда металл соединяется с субстратом, образуя истинный субстрат, на который действует фермент.

В частности, ионы Mg2+активируют креатинфосфокиназу благодаря образованию истинного субстрата – магниевой соли АТФ.

Наконец, имеются экспериментальные доказательства прямого участия металлов (например, ионов Са2+ в молекуле амилазы слюны) в формировании и стабилизации активного центра и всей трехмерной структуры молекулы фермента.

Анионы в физиологических концентрациях обычно неэффективны или оказывают небольшое активирующее влияние на ферменты. Исключение составляют пепсин, некоторые оксидоредуктазы, активируемые анионами, а также амилаза слюны, катализирующая гидролиз крахмала, активность которой повышается при действии ионов хлора, и аденилатциклаза, которая активируется анионами галогенов.

Активаторы ферментов.Ферменты-протеинкиназы имеют четвертичную структуру, состоят их 2-х субъединиц — каталитической и регуляторной. Активатор воздействует на регуляторную, а в результате обнажается каталитическая субъединица:

Рисунок 21—Воздействие активатора

Кооперативный эффект.Характерен для ферментов, имеющих 2 и более субъединиц. Присоединение субстрата к одной из субъединиц облегчает последующие присоединения к оставшимся субъединицам. Типичный пример кооперативного эффекта — перенос кислорода молекулами гемоглобина.

Ингибиторы ферментов обычно принято делить на два больших класса: обратимые и необратимые. Это вещества, вызывающие частичное (обратимое) или полное торможение реакций, катализируемых ферментами.

Недавно открыты антиферменты (антиэнзимы), представляющие собой белки (или полипептиды), действующие как ингибиторы ферментов. К подобным веществам относятся, например, ингибитор трипсина, обнаруженный в соевых бобах, и сывороточный антитрипсин. Недавно открыт в печени животных антифермент орнитиндекарбоксилазы.

Антиэнзимы, вероятнее всего, образуют труднодиссоциируемые комплексы с соответствующими ферментами, выключая их из химических реакций.

Иногда ингибитор является составным компонентом предшественника фермента или входит в состав сложных комплексов ферментов, например в состав протеинкиназы и протеинфосфатазы, катализирующих процессы фосфорилирования-дефосфорилирования в живых организмах.

Ферменты являются белками, поэтому любые агенты, вызывающие денатурацию белка (кислоты, щелочи, соли тяжелых металлов, нагревание), приводят к необратимой инактивации фермента. Однако подобное инак-тивирование относительно неспецифично, оно не связано с механизмом действия ферментов.

Гораздо большую группу составляют так называемые специфические ингибиторы, которые оказывают свое действие на какой-либо один фермент или группу родственных ферментов, вызывая обратимое или необратимое ингибирование.

Ингибиторы могут дать ценную информацию о химической природе активного центра фермента, а также о составе его функциональных групп и природе химических связей, обеспечивающих образование фермент-субстратного комплекса.

Действие ряда ферментов (холинэстераза, трипсин и химотрипсин) сильно тормозится некоторыми фосфорорганическими соединениями, например ДДТ, вследствие блокирования ключевой гидроксильной группы серина в активном центре.

При помощи ингибиторов, выключающих отдельные стадии многоступенчатого метаболического процесса, могут быть точно установлены не только последовательность химических реакций, но и природа участвующих в этих превращениях ферментов.

Этим путем, применяя йодацетат, фториды и другие специфические ингибиторы, был расшифрован гликолитический путь окислительно-восстановительных превращений глюкозы до стадии образования молочной кислоты в мышечной ткани, насчитывающий 11 стадий с участием 11 ферментов и 10 промежуточных метаболитов.

С ингибированием ферментов связан механизм действия многих токсинов и ядов на организм.

Известно, что при отравлениях солями сенильной кислоты смерть наступает вследствие полного торможения и выключения дыхательных ферментов (цитохромная система) тканей, особенно клеток мозга.

Токсическое влияние на организм человека и животных некоторых инсектицидов обусловлено торможением активности холинэстеразы – фермента, играющего ключевую роль в деятельности нервной системы.

Современная, так называемая рациональная, химиотерапия (направленное применение лекарственных препаратов в медицине) должна основываться на точном знании механизма действия лекарственных средств на биосинтез ферментов, на активность уже синтезированных ферментов или на регуляцию их активности в организме.

Иногда для лечения некоторых болезней используют избирательно действующие ингибиторы. Так, ингибитор ряда протеиназ (трипсина, химотрипсина и калликреина) трасилол широко применяется для лечения острого панкреатита – болезни, при которой уровень трипсина и химотрипсина в крови резко возрастает.

Знание избирательного ингибиторного действия некоторых природных и синтетических соединений (так называемых антиметаболитов) на ферменты может служить методологической основой для разработки эффективных методов синтеза химиотерапевтических препаратов.

Этот путь открывает широкие возможности для направленного воздействия на синтез ферментов в организме и регуляции интенсивности метаболизма при патологии.

Типы ингибирования.Различают обратимое и необратимое ингибирование. Если ингибитор вызывает стойкие изменения пространственной третичной структуры молекулы фермента или модификацию функциональных групп фермента, то такой тип ингибирования называется необратимым.

Чаще, однако, имеет место обратимое ингибирование, поддающееся количественному изучению на основе уравнения Михаэлиса-Ментен. Обратимое ингибирование в свою очередь разделяют на конкурентное и неконкурентное в зависимости от того, удается или не удается преодолеть торможение ферментативной реакции путем увеличения концентрации субстрата.

Конкурентное ингибирование может быть вызвано веществами, имеющими структуру, похожую на структуру субстрата, но несколько отличающуюся от структуры истинного субстрата.

Такое ингибирование основано на связывании ингибитора с субстратсвязывающим (активным) центром. Классическим примером подобного типа ингибирования является торможение сукцинатдегидрогеназы (СДГ) малоновой кислотой.

Этот фермент катализирует окисление путем дегидрирования янтарной кислоты (сукцината) в фумаровую:

Если в среду добавить малонат (ингибитор), то в результате структурного сходства его с истинным субстратом сукцинатом (наличие двух таких же ионизированных карбоксильных групп) он будет взаимодействовать с активным центром с образованием фермент-ингибиторного комплекса, однако при этом полностью исключается перенос атома водорода от малоната. Структуры субстрата (сукцинат) и ингибитора (малонат) все же несколько различаются. Поэтому они конкурируют за связывание с активным центром, и степень торможения будет определяться соотношением концентраций малоната и сукцината, а не абсолютной концентрацией ингибитора. Таким образом, ингибитор может обратимо связываться с ферментом, образуя фермент-ингибиторный комплекс. Этот тип ингибирования иногда называют ингибированием по типу метаболического антагонизма (рис. 22).

Е — фермент; S — субстрат; Р1 и Р2 — продукты реакции; I — ингибитор

Рисунок 22—Действие конкурентного ингибитора (схема по В.Л. Кретовичу)

В общей форме реакция взаимодействия ингибитора с ферментом может быть представлена следующим уравнением:

Образовавшийся комплекс, называемый фермент-ингибиторным комплексом ЕI, в отличие от фермент-субстратного комплекса ES не распадается с образованием продуктов реакции. Константу диссоциации комплекса EI, или ингибиторную константу Кi, можно, следуя теории Михаэлиса–Ментен, определить как отношение констант обратной и прямой реакций:

т.е. ингибиторная константа прямо пропорциональна произведению концентрации фермента и ингибитора и обратно пропорциональна концентрации комплекса EI.

Метод конкурентного торможения нашел широкое применение в медицинской практике. Известно, например, что для лечения некоторых инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, применяют сульфаниламидные препараты.

Оказалось, что эти препараты имеют структурное сходство с парааминобензойной кислотой, которую бактериальная клетка использует для синтеза фолиевой кислоты, являющейся составной частью ферментов бактерий.

Благодаря этому структурному сходству сульфаниламид блокирует действие фермента путем вытеснения парааминобензойной кислоты из комплекса с ферментом, синтезирующим фолиевую кислоту, что ведет к торможению роста бактерий.

Некоторые аналоги витамина В6 и фолиевой кислоты, в частности дезоксипиридоксин, действуют как конкурентные, так называемые коферментные, ингибиторы (или антивитамины), тормозящие многие интенсивно протекающие при патологии биологические процессы в организме. Применение подобных аналогов в медицинской практике (в частности, в дерматологии и онкологии) основано на конкурентном вытеснении коферментов из субстратсвязывающих центров ключевых ферментов обмена.

Неконкурентное ингибирование вызывается веществами, не имеющими структурного сходства с субстратами и часто связывающимися не с активным центром, а в другом месте молекулы фермента. Степень торможения во многих случаях определяется продолжительностью действия ингибитора на фермент.

При данном типе ингибирования благодаря образованию стабильной ковалентной связи фермент часто подвергается полной инактивации, и тогда торможение становится необратимым. Примером необратимого ингибирования является действие йодацетата, ДФФ, а также диэтил-n-нитрофенилфосфата и солей синильной кислоты.

Это действие заключается в связывании и выключении функциональных групп или ионов металлов и молекуле фермента.

Следует указать, что неконкурентное ингибирование также может быть обратимым и необратимым, поскольку отсутствует конкуренция между субстратом и ингибитором за активный центр. Примеры необратимого ингибирования приведены ранее.

При обратимом неконкурентном ингибировании субстрат S и ингибитор I связываются с разными центрами, поэтому появляется возможность образования как комплекса EI, так и тройного комплекса EIS; последний может распадаться с освобождением продукта, но с меньшей скоростью, чем комплекс ES.

Этот тип неконкурентного ингибирования чаще всего наблюдается у ферментов, катализирующих превращения более одного субстрата, когда связывание ингибитора не блокирует связывание субстрата с активным центром. Ингибитор при этом соединяется как со свободным ферментом, так и с ES-комплексом.

Известно, кроме того, так называемое бесконкурентное ингибирование, когда ингибитор связывается с ферментом также в некаталитическом центре, однако не со свободным ферментом, а только с ES-комплексом в виде тройного комплекса.

Мультимолекулярные ферментные системы.Особую группу ферментов составляют надмолекулярные (или мульти-молекулярные) ферментные комплексы, в состав которых входят не субъединицы (в каталитическом отношении однотипные протомеры), а разные ферменты, катализирующие последовательные ступени превращения какого-либо субстрата.

Отличительными особенностями подобных мультиферментных комплексов являются прочность ассоциации ферментов и определенная последовательность прохождения промежуточных стадий во времени, обусловленная порядком расположения каталитически активных (различных) белков в пространстве («путь» превращения в пространстве и времени).

Типичными примерами подобных мультиферментных комплексов являются пируватдегидрогеназа и α-кетоглутаратдегидрогеназа, катализирующие соответственно окислительное декарбоксилирование пировиноградной и α-кетоглутаровой кислот в животных тканях, и синтетаза высших жирных кислот.

Молекулярные массы этих комплексов в зависимости от источника их происхождения варьируют от 2,3•106 до 10•106.

Ряд таких мультиферментных комплексов, иногда называемых ферментными ансамблями, структурно связанных с какой-либо органеллой (рибосомы, митохондрии) или с биомембраной и составляет высокоорганизованные надмолекулярные системы, обеспечивающие жизненно важные функции, например, тканевое дыхание (перенос электронов от субстратов к кислороду через систему дыхательных ферментов).

Изменение активности катепсина Д в тканях сеголеток карпа под влиянием солей тяжелых металлов — Успехи современного естествознания (научный журнал)

1

Курбанова С.И. 1

Нурмагомедова П.М. 1

Рабазанов Н.И. 1
1 Дагестанский государственный универсистет
Cтатья посвящена исследованию влияния хлорида кадмия (0,25 мг/л) и ацетата свинца (0,5 мг/л) на активность катепсина Д в тканях сеголеток карпа.

Результаты наших исследований свидетельствуют о наличии тканеспецифичности в изменении активности катепсина Д в ответ на действие ионов тяжелых металлов.Предлагается использовать показатели протеолитических ферментов в тканях рыб в качестве чувствительного теста на загрязнение водной среды ионами тяжелых металлов.

1. Волошина Г.В.

Экологическая оценка состояния поверхностных вод реки Понура // Эколог. вест. Север. Кавказа. – 2006. – Т.2. – № 1. – С. 118–122.
2. Крючков В.Н., Фомин И.В. Изучение адаптации печени карпа к токсическому воздействию кадмия и ее регенерация // Вест. Рос. унвер. Дружбы народов, Серия «Экология и безопасность жизнедеятельности». – 2005. – Т. 12, № 2.
3. Лакин Г.Ф. Биметрия.

– М.: Высшая школа, 1990. – 352 с.
4. Минина Л.И. Методические указания к практикуму «Анализ объектов окружающей среды». Определение массовой концентрации меди, свинца, кадмия в поверхностных водах суши инверсионным вольтамперметрическим методом / под ред. Е.М. Цыганков. – Ростов-на-Дону, 2003. – 26 с
5. Немова Н.Н., Высоцкая Р.У. Биохимическая индикация состояния рыб. – М.

: Наука, 2004. – 216 с.
6. Нефедова З.А., Руоколайнен Т.Р., Васильева О.Б., Немова Н.Н., Шарова Ю.Н. Особенности состава тканевых липидов сига CoregonusLavaretus, обитающего в водоемах с разной антропогенной нагрузкой // Вопр. ихтиологии. – 2007. – Т. 47. – № 1. – С. 107–112.
7. Нурмагомедова П.М., Березин В.А., Эмирбеков Э.З., Рева А.Д.

Влияние гипотермии на субклеточное распределение и некоторые физико-химические свойства катепсина Д в головном мозгу крыс // Укр. биох. журн. – 1983. – Т. 55, № 2. – С. 175–178.
8. Обухов Д.К., Крючков В.И. Исследование влияния нефтяного загрязнения на морфофункциональное развитие молоди осетровых рыб // Вопр. рыболовства. – 2000. – Т. 1. – Вып.4. – С. 98–117.
9.

Трахтенберг И.М., Шафран Л.М Тиоловые яды // Общая токсикология; под ред. Б.А. Курдлянского, В.А. Филова. – М.: Медицина, 2002. – С. 111–175.
10. Шулькин В.М. Металлы в экосистемах морских мелководий. – Владивосток, 2004. – 279 с.
11. Giri S.N., Hollinger M.A. Effect of cadmium on lung lysosomales enzymes in vitro // Arch. Toxicol. – 1995. – Vol. 69. – № 5. – P. 341–345.

В последние десятилетия загрязнение водных экосистем тяжелыми металлами приобретает значительные масштабы. К числу наиболее токсичных металлов относятся: марганец, свинец, кадмий, ртуть, медь, кобальт и др.

Тяжелые металлы аккумулируясь в тканях и включаясь в пищевые цепи гидробионтов оказывают существенное влияние на физиолого-биохимические показатели рыб, обладают канцерогенными, гонадо- и эмбриотоксичными свойствами [6].

Изучение влияния тяжелых металлов на метаболизм тканей обмен рыб актуально для выявления механизмов патогенеза и поиска чувствительных маркеров для мониторинга водных экосистем. В основе патологии лежат нарушения ферментативных процессов.

Весьма чувствительными индикаторами на изменение экологической обстановки являются ферменты лизосом. Система лизосомальных ферментов на 90 % представлена катепсинами, что имеет наиболее важное значение для адаптации белкового состава клеток к изменяющимся условиям окружающей среды [5].

Маркером состояния лизосомальных структур в клетке, является катепсин Д. Поэтому изучение динамики активности катепсина Д в тканях рыб в условиях хронической интоксикации ионами кадмия и свинца, представляется актуальным. На базе этих исследований могут быть разработаны дополнительные высокочувствительные тестовые системы для биохимического мониторинга водных экосистем.

Материал и методы исследования

В качестве объекта исследования использованы сеголетки карпа (Cyprinuscarpio L.) в возрасте 6 месяцев, массой 100–150 г, полученные и выращенные в прудах Широкольского комбината Тарумовского района республики Дагестан, перед их переброской в пруды для зимовки, отлавливались и переносились в аквариумы объемом 300 литров по 15–20 штук.

• Для адаптации к аквариальным условиям рыб выдерживали в течение 7–10 суток в аквариумах, где создавались условия постоянного температурного (19–22 °С) и газового режима.
• В хронических лабораторных опытах были испытаны:
• – хлорид кадмия (CdCl2) с содержанием в водной среде 0,25 мг/дм3 (ПДК – 0,005 мг/дм3)
• – ацетат свинца (Pb(CH3COO)2) с содержанием в водной среде 0,5 мг/л (ПДК – 0,1 мг/дм3) [1, 4].

Биохимические анализы проводили на 5, 15, 30 и 40 сутки экспозиции рыб в токсической среде параллельно с контрольной группой. В опыт брали ткани из следующих органов: печень, кишечник, головной мозг, белая и красная мышца. Активность катепсина Д определяли методом Ансона с некоторыми модификациями [7].

Полученные результаты подвержены вариационно – статистической обработке методом малой выборки [3].

Результаты исследования и их обсуждение

Как показывают наши результаты динамика активности катепсина Д в исследованных тканях сеголеток карпа при хроническом воздействии хлорида кадмия и ацетата свинца подвержена значительным отклонениям от нормы (рис. 1, 2).

Они свидетельствуют о наличии тканеспецифичности в изменении активности лизосомальных протеаз в ответ на действие повреждающего агента.

Содержание в водной среде с хлоридом кадмия (0,25 мг/л) и ацетата свинца (0,5 мг/л) в течение 5 суток приводит к повышению активности катепсина Д в печени по сравнению с контролем почти вдвое (рис. 1, 2).

Рис. 1. Изменение активности катепсина Д в тканях сеголеток карпа при хроническом воздействии хлорида кадмия (в % к контролю)

Печень один из самых важных органов живого организма поддерживающих его гомеостаз. Она подвергается наиболее сильному воздействию загрязняющих веществ, которые в нем и обезвреживаются [2].

Активность катепсина Д в кишечнике сеголеток карпа под воздействием ионов кадмия повышается в 2,9 раза и на 51,6 % в среде с ионами свинца.

Экспозиция сеголеток карпа в течение 5 дней в токсической среде с хлоридом кадмия приводит к повышению активности катепсина Д по сравнению с контролем в красных мышцах в 2,6 раза, в белых мышцах в 3,4 раза, в то время как ацетат свинца не оказал существенного влияния на активность данного фермента в этих тканях.

Многие исследователи указывают, что мышцы рыб благодаря большой массе играют значительную роль в накоплении тяжелых металлов, хотя и занимают среднее место по их содержанию [10].

Рис. 2. Изменение активности катепсина Д в тканях сеголеток карпа при хроническом воздействии ацетата свинца (в % к контролю)

Активность катепсина Д в мозге сеголеток карпа повышается под воздействием ионов кадмия в 1,8 раза, а под воздействием ионов свинца повышается незначительно по сравнению с контролем. Из числа различных систем организма большое значение имеют регуляторные, к которым относится ЦНС, эндокринная, иммунная.

Первоначальные нарушения мышечной, сердечно-сосудистой, дыхательной, пищеварительной систем в процессе интоксикации могут существенно повлиять на функцию регуляторных систем.

Например, известны факты, свидетельствующие о расстройстве ЦНС в результате накопления вредных метаболитов, которые при определенном уровне с кровью проникают через ГЭБ в головной мозг [8].

По нашим данным на 15 день интоксикации рыб в токсической среде с хлоридом кадмия и ацетатом свинца наблюдаются, разнонаправленные изменения в динамике активности катепсина Д.

В печени карпа активность катепсина Д под воздействием ионов кадмия продолжает повышаться (100,8 %), в то время как под воздействием ионов свинца наметилась тенденция к снижению.

На данном этапе интоксикации ионами кадмия активность катепсина Д в кишечнике сеголеток карпа все еще выше контроля в 2,5 раза, а под воздействием ионов свинца она возвращается к норме.

Активность катепсина Д в красных и белых мышцах сеголеток карпа под воздействием ионов кадмия выше контроля в 3,4 и 4,2 раза соответственно, а свинца – в 2 раза соответственно. Ионы кадмия и свинца повышает активность катепсина Д в головном мозге сеголеток карпа по сравнению с контролем почти в 2 раза.

Таким образом, результаты начальных этапов экспозиции (5,15 дни) показывают более выраженную активацию катепсина Д во всех тканях сеголеток карпа под воздействием ионов кадмия по сравнению с ионами свинца.

Продление сроков пребывания сеголеток карпа в среде с ионами кадмия и свинца до 30 дней приводит к снижению активность катепсина Д в печени на 39,5 и 29,2 %, соответственно, по отношению к контролю. Тенденция к снижению сохраняется и на 40 день интоксикации.

В кишечнике карпа к 30 дню интоксикации ионами кадмия и свинца активность катепсина Д не отличается от нормы. А уже к 40 дню эксперимента активность фермента в кишечнике сеголеток карпа ниже контроля как под воздействием ионов кадмия (на 41,9 %), так и свинца (на 27,5 %).

Пребывание сеголеток карпа до 30 дней в среде с ионами кадмия повышает активность катепсина Д в красных мышцах на 45,4 %, а с ионами свинца 60 %, в белых мышцах активность в обоих случаях повышена одинаково в 1,8 раза.

При пролонгировании интоксикации до 40 дней активность катепсина Д в красных и белых мышцах снижается.

В мозговой ткани сеголеток карпа активность катепсина Д на 30 день интоксикации ионами кадмия и свинца все еще выше контроля на 78,9 и 27,8 %. При продлении сроков интоксикации до 40 дней ионами кадмия активность катепсина Д в мозге карпа возвращается к норме, а ионами свинца остается выше контрольного уровня.

Из полученных результатов видно, что максимальная активность катепсина Д под воздействием ионов кадмия во всех тканях карпа приходится на 5 и 15 дни эксперимента, а уже к 30 дню она начинает снижаться и к 40 дню практически не отличается от нормы.

Первая реакция на интоксикацию проявляется неспецифической реакцией лизосом и активация лизосомальных ферментов, а степень и временная динамика изменений ферментативной активности зависят от специфики действующего фактора. В данном случае уже на 5 день повышение активности катепсина Д карпа при интоксикации ионами, как кадмия, так и свинца свидетельствуют об этом.

Первоначальное повышение активности катепсина Д в исследуемых тканях и органах, видимо связано с лабилизацией мембран лизосом.

К веществам, оказывающим лабилизирующий эффект на мембраны лизосом, относятся ионы кальция и магния, железа, неорганическая ртуть, хлорид кадмия, ацетат свинца, лизолецитин и другие продукты гидролиза липидов кислыми липазами, гормоны, соли желчных кислот и др. [9].

Последующее снижение активности катепсина Д при длительном влиянии ионов кадмия и свинца может быть результатом стабилизации мембран лизосом, однако нельзя исключить и возможность ингибирования активности катепсина Д ионами металлов [11].

Библиографическая ссылка

Курбанова С.И., Нурмагомедова П.М., Рабазанов Н.И. Изменение активности катепсина Д в тканях сеголеток карпа под влиянием солей тяжелых металлов // Успехи современного естествознания. – 2013. – № 1. – С. 43-45;
URL: https://natural-sciences.ru/ru/article/view?id=31280 (дата обращения: 01.07.2022).

Сетевое издание Современные проблемы науки и образования ISSN 2070-7428 "Перечень" ВАК ИФ РИНЦ = 0,940

1

Подолец А.А. 1

Феоктистова И.Д. 1
1 Владимирский государственный университет им. А.Г. т Н.Г. Столетовых
В данной статье исследуются вопросы влияния антропогенного воздействия на биохимические параметры почвы.

В качестве загрязнителя был выбран отход машиностроительных предприятий – гальванический шлам, содержащий опасные для окружающей среды тяжелые металлы.

В почвенных образцах, в которые были внесены высокие дозы ионов тяжелых металлов, были проведены измерения активности ферментов, катализирующих наиболее важные биохимические процессы, протекающие в почве: каталазы, отвечающей за разложение перекиси водорода, уреазы, катализирующей гидролиз мочевины, целлюлозолитической активности, нитрифицирующей активности, для выяснения способности почв к мобилизации органических соединений азота и активности почвенного дыхания. Проведенные исследования показали, что под действием высоких концентраций тяжелых металлов происходит угнетение ферментативной активности почвы, причем наблюдается неодинаковое по степени воздействие тяжелых металлов на биохимические параметры почв. По результатам работы составлен ряд, отражающий чувствительность почвенных ферментов к загрязнению тяжелыми металлами. Наиболее чувствительной к воздействию тяжелых металлов в этом ряду оказалась целлюлозолитическая активность.

ферментативная активность

1. Бабьева И.П., Агре Н.С. Практическое руководство по биологии почв. — М.: Изд-во МГУ, 1971. — 140 с.
2. Вяль Ю.А. Оценка биологической активности почв городских ландшафтов (на примере г. Заречный) / Ю.А. Вяль, А.В. Шиленков // Известия Пензенского государственного педагогического университета им. В.Г. Белинского. Естественные науки. — 2009. — № 14 (18). — С. 7–10.
3. Гусев М.В. Микробиология / М.В. Гусев, Л.А. Минеева: учебник для студ. биол. специальностей вузов. Изд. 4-е, стер. — М.: Издательский центр «Академия», 2003. — 464 с.
4. Ежегодный доклад «О состоянии окружающей среды и здоровья населения Владимирской области в 2012 году». Владимир. — Вып. 20. — 2013. – 106 с.
5. Казеев К.Ш., Колесников С.И., Вальков В.Ф. Биологическая диагностика и индикация почв: методология и методы исследований. Ростов н/Д: Изд-во РГУ, 2003. 216 с.
6. Мукинина И.А. Влияние экологических факторов на биологическую активность серых лесных почв // Лесоведение. — 2005. — № 5. — С. 41–45.
7. Практикум по агрохимии / Под ред. Минеева В.Г. — М.: Изд-во МГУ, 1989. – 304 с.
8. Селиванов О.Г., Чухланов В.Ю., Селиванова Н.В., Михайлов В.А., Савельев О.В. Оценка экологической опасности полимерных строительных покрытий, наполненных гальваническим шламом // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. — 2013. — Т. 15. — № 3(6). — С. 1956–1960.
9. Трифонова Т.А., Селиванова Н.В., Селиванов О.Г., Ширкин Л.А. Утилизация гальваношламов сложного состава // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. — 2012. — Т. 14. — № 5(3). — С. 850–852.
10. Хазиев Ф.Х. Методы почвенной энзимологии. — М.: Наука, 2005. — 252 с. 11. Чухланов В.Ю., Селиванов О.Г., Селиванова Н.В. Разработка защитного полимерного покрытия повышенной огнестойкости на основе модифицированного полиуретана, наполненного шламовым отходом // Современные проблемы науки и образования. — 2014. — № 3. URL:www.science-edication.ru / 117-13214 (дата обращения: 09.07.2015)

В современном мире процессы урбанизации становятся все интенсивнее, их масштабы постоянно увеличиваются. Все компоненты окружающей среды урбанизированных территорий испытывают постоянное давление техногенного пресса. Состояние почв городских территорий требует особого внимания, так как влияние транспорта, промышленности, процессов строительства приводит к «компрессии» почвенной системы, ведет к изменению практически всех ее компонентов, начиная с агрохимических и физических свойств и заканчивая микробиологическими и биохимическими показателями, лишая почвенный покров в городах способности выполнять экологические функции. Микробиота и биохимические параметры почвы под влиянием антропогенного воздействия изменяются в первую очередь, поэтому именно они считаются многими исследователями наиболее чувствительными к загрязнению показателями состояния почвенного покрова [2]. В силу особенностей промышленного производства (таких как машиностроение, приборостроение, металлообработка) во Владимирской области ежегодно образуется значительное количество промышленных отходов, содержащих тяжелые металлы и, в частности, гальванические шламы (ГШ). Чтобы уменьшить количество образующихся ГШ, их предлагается утилизировать [9, 11], причем полученные товарные продукты, содержащие в своем составе в качестве добавки ГШ, должны быть экологически безопасны для окружающей среды [8]. Однако большая часть отходов, содержащих тяжелые металлы, остается на территориях промышленных предприятий или вывозится на несанкционированные свалки, что ведет к загрязнению почв и грунтов, из которых ТМ активно мигрируют в сопредельные среды.

• Цель исследования
• Изучить пространственную изменчивость ферментативной активности почв городских территорий, загрязненных тяжелыми металлами, для оценки экологического состояния почвы.
• Объекты и методы исследования

Для установления характера зависимости ферментативной активности почвы от уровня загрязнения тяжелыми металлами в лабораторных условиях был поставлен опыт в вегетационных сосудах. ТМ вносили в почву в составе промышленных отходов — осадков нейтрализации гальваностоков, полученных с одного из приборостроительных заводов Владимирской области, в количестве 3,5 кг/м2.

Почвенные пробы для анализа отбирали с участков на глубинах (см) от 0-15, 15-30, 30-45 тростьевым буром. С каждого вегетационного сосуда на каждой из глубин отбиралось по три объединенные пробы.

Отбор и анализ проб проводили через 3 месяца после внесения гальваношлама.

Для постановки опытов в лабораторных условиях использовалась дерново-подзолистая почва, отобранная с реперного участка Владимирской области.

В почвенных образцах определяли следующие показатели: целлюлозолитическую активность (аппликационным методом в чашках Петри путем учета остаточного количества нерасщепленной целлюлозы [1]); каталазную активность и дыхание почвы (газометрическим методом [5]), уреазную активность (фотоколориметрически [7]), нитрифицирующую активность (потенциометрическим методом). Определение валового содержания ТМ проводили рентгеноспектральным флуоресцентным методом на приборе «Spectroskan-МАКС-G».

Результаты исследования и их обсуждение

 Для исследования влияния ТМ на показатели ферментативной активности, был проведен анализ почвы, который показал, что после внесения ГШ в дозе 3,5 кг/м2 валовое содержание ТМ в корнеобитаемом слое почвы стало превышать его концентрацию на незагрязненной почве и стало характеризоваться как «очень высокое» (табл. 1).

Таблица 1

Содержание тяжелых металлов в исследуемой почве, после внесения ГШ в количестве 3,5 кг/м2

Полученные данные указывают на значительные превышения концентраций ТМ относительно контроля в 144,4, 154 и в 11,4 раз по никелю, меди и хрому соответственно.

Исследованиями, проведенными С.И.

Колесниковым с соавторами, установлено, что при загрязнении почвы ТМ одними из первых нарушаются функции почвы, связанные преимущественно с ее химическими, физико-химическими и биохимическими свойствами: источник элементов питания и энергии, сорбция веществ и микроорганизмов, стимулятор и ингибитор биохимических и других процессов. Выполнение этих функций, в частности, зависит от активности ферментов.

В исследованной почве было проведено измерение активности ферментов, катализирующих наиболее важные биохимические процессы, протекающие в почве: каталазы, отвечающей за разложение перекиси водорода, уреазы, катализирующей гидролиз мочевины, целлюлозолитической активности, нитрифицирующей активности, для выяснения способности почв к мобилизации органических соединений азота и активность почвенного дыхания.

Изучение интенсивности нитрификации показало, что почва контрольных образцов характеризуется большей активностью процесса нитрификации по сравнению с почвой с высоким содержанием тяжелых металлов. Высокая интенсивность нитрификации в почвах свидетельствует о завершении переработки продуктов распада органических соединений и активно идущем процессе самоочищения (табл. 2).

Таблица 2

Активность процесса нитрификации почвы с высоким содержанием ТМ

 Отмечалось снижение активности нитрификации по профилю.

Роль каталазы в почве велика и заключается в разрушении опасной для растений перекиси водорода, образующейся в процессе дыхания растений и в результате биохимических реакций окисления органических веществ [3].

Каталазная активность исследованной почвы уменьшалась по профилю в большинстве изученных образцов (табл.

3), что представляется закономерным, так как количество органического вещества уменьшается в почве вниз по профилю, однако результаты, полученные в образцах с содержанием высоких концентраций ТМ, несколько выше контрольных.

Таблица 3

Каталазная активность почвы с высоким содержанием ТМ

Это можно объяснить разрушающим действием металлов на перекись водорода. Так, при добавлении незначительных количеств солей железа к растворам перекиси водорода, содержащих медную соль, наблюдалось увеличение скорости разложения на 200%. Резкое выраженное каталитическое действие оказывают ионы меди и железа, несколько более слабое — ионы хрома.

 Результаты исследования уреазной активности почвы показали, что скорость разложения мочевины в верхнем слое контрольных образцов, изменяется в диапазоне 18,6-26,3 мг NHз/10 г почвы в сутки и может считаться высокой. В образцах, подвергающихся влиянию тяжелых металлов, скорость разложения мочевины снижается и составляет в среднем 15,9-16,8 мг NHз/10 г почвы в сутки (табл. 4).

Таблица 4

Уреазная активность почвы с высоким содержанием ТМ

 В ходе исследований была изучена динамика целлюлозолитической активности почвы (табл. 5). При оценке целлюлозолитической активности почв (%) использовали следующую шкалу: очень слабая < 10, слабая 10-30, средняя 30-50, сильная 50-80, очень сильная > 80.

Таблица 5

Целлюлозолитическая активность почвы с высоким содержанием ТМ

Дерново-подзлистые почвы в контрольных образцах характеризуются средней (очень слабой) целлюлозолитической активностью (степень разложения фильтра >30 %), так как они бедны органическим веществом, азотом, подвижными формами фосфора и калия, а именно эти условия обусловливают высокую интенсивность разложения целлюлозы. Исследованные нами почвенные образцы загрязненной почвы по большей части характеризуются слабой целлюлозолитической активностью (степень разложения фильтра 10-30%) (табл. 5), это объясняется тяжелыми металлами, присутствующими в почве. Исследования показали, что верхний слой почвы в большинстве случаев обладал более высокой целлюлозолитической активностью по сравнению с нижележащими слоями. Нижележащие слои в загрязненной почве обладали очень слабой целлюлозолитической активностью (

Содержание микроэлементов в нервной ткани и ишемический инсульт

Сосудистые заболевания головного мозга — одна из ведущих причин заболеваемости, смертности и инвалидизации в Российской Федерации [1].

Доля острых нарушений мозгового кровообращения в структуре общей смертности в нашей стране составляет 21,4%, а инвалидизация после перенесенного инсульта достигает 3,2 на 10 000 населения, занимая 1-е место среди всех причин первичной инвалидности.

В Российской Федерации инсульт ежегодно развивается более чем у 450 000 человек, из которых примерно 35% умирают в остром периоде заболевания [2]. Сосудистые поражения мозга занимают в экономически развитых странах 2-3-е место среди причин смерти [3].

Летальный исход при ишемическом инсульте (ИИ) в первые 30 дней наступает у 15-25% пациентов. Атеротромботический и кардиоэмболический инсульты наиболее опасны и характеризуются наивысшей смертностью [4, 5].

В настоящее время большое внимание уделяется изучению патогенетических механизмов развития ИИ, его этиологических факторов, оказанию лечебной помощи и проведению реабилитационных мероприятий.

Существенными факторами риска ИИ являются уровни макро- и микроэлементов (МаЭ и МЭ соответственно) в различных тканях организма, в том числе в ЦНС.

В организме человека обнаружен 81 химический элемент, при этом 15 из них (железо — Fe, йод — I, медь — Cu, цинк — Zn, кобальт — Co, хром — Cr, молибден — Mo, никель — Ni, ванадий — V, селен — Se, марганец — Mn, мышьяк — As, фтор — F, кремний — Si, литий — Li) являются эссенциальными, т.е. жизненно необходимыми [6, 7].

Участие МаЭ и МЭ в физиологических процессах многообразно. Так, МЭ участвуют в формировании каталитических центров и стабилизации регуляторных сайтов в составе многих ферментов. Показана ключевая роль МаЭ и МЭ в сложных биохимических процессах, составляющих основу деятельности ЦНС. Доказана регуляторная функция нервной системы в поддержании гомеостаза МаЭ и МЭ всего организма человека [8].

Магний (Mg) является регулятором активности глутаматных рецепторов, он необходим для поддержания энергетического метаболизма нейронов и обезвреживания избытка катехоламинов [9].

МЭ-зависимые антиоксидантные ферменты, такие как Cu,Zn-зависимая и Mg-зависимая супероксиддисмутазы (СОД), каталаза, Se-зависимая глутатионпероксидаза являются неотъемлемой частью внутриклеточных механизмов устранения последствий окислительного стресса, уровни их экспрессии существенно повышаются при ИИ [10].

Исследования уровней эссенциальных, токсических и условно-токсических элементов в различных биосубстратах (волосы, ногти, плазма крови, моча, материалы биопсий и др.

) проведены у пациентов, получающих гемодиализ [11, 12]), курильщиков и алкоголиков, пациентов с артериальной гипертензией (АГ) [13], ревматоидным артритом [14], сахарным диабетом [15], аутизмом [16].

Однако к настоящему времени исследования изучения содержания микроэлементов при ИИ были лишь единичными.

Сравнительный анализ содержания Zn, Cu, Mg методом атомно-абсорбционной спектрометрии в волосах 45 пациентов с ИИ и 20 человек без ИИ (контрольная группа) показал, что уровни этих элементов в волосах пациентов (79±25, 8±1 и 24±10 мкг/кг соответственно) были значительно ниже, чем в контрольной группе (168±29, 18±2 и 93±47 мкг/кг, р150 мкмоль/л) снижают жизнеспособность нейронов [37]. У пациентов, перенесших ИИ, уровень Zn2+ в плазме был значительно ниже, чем в контроле (р=0,001) [38]. При добавлении Zn2+ в суточный рацион больных с ИИ на 30-й день наблюдался значительно более полный регресс неврологического дефицита [39].

Mn — кофактор более 200 белков. В клетках значительная часть его запасов сосредоточена в митохондриях, им наиболее богаты мозг, печень, почки, плацента, поджелудочная железа, кишечник. Адекватный уровень потребления Mn составляет 2 мг в сутки. Дефицит Mn наблюдается при различных формах анемии, детском церебральном параличе, сахарном диабете, задержках развития [20].

Ионы Mn необходимы для поддержания различных физиологических процессов: кроветворения, иммунитета (стимулируют рост Т- и В-клеток, фагоцитоз), метаболизма катехоламинов, антиоксидантной защиты нейронов, энергетического метаболизма (расщепление углеводов и жиров), метаболизма соединительной ткани.

Среди Mn-зависимых ферментов отметим гуанилат-циклазы, вовлеченные в передачу сигнала от NO азота и малатдегидрогеназу (энергетический метаболизм).

Гуанилатциклазы модулируют передачу сигнала от NO, который диффундирует внутрь клеток гладкой мускулатуры и активирует гуанилатциклазу, участвующую в синтезе циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) из гуанозинтрифосфата (ГТФ).

Молекулы цГМФ активируют протеинкиназу G (PKG), фосфорилирующую белки, которые регулируют уровни Ca, чувствительность нейронов и клеток гладкой мускулатуры сосудов к Ca, гиперполяризацию клетки через K-каналы, актин, миозин, что и приводит в конечном итоге к вазодилатации [40]. Для каталитической активности гуанилатциклаз необходим гем как кофактор; ионы Mn активируют фермент [41].

Малатдегидрогеназа — один из ферментов, вовлеченных в аэробное клеточное дыхание.

Расположен в матриксе митохондрии и связывает две ветви метаболизма сахаров: гликолиз и цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса).

Малатдегидрогеназа имеет НАДФ (никотинамид динуклеотид, производное витамина РР) и ионы Mn в качестве кофакторов и катализирует превращение малата в пируват — основой субстрат цикла трикарбоновых кислот.

Повышенная концентрация супероксид-радикалов причастна к усилению повреждений головного мозга при ишемии.

Посредством Mn-зависимой СОД, одного из самых важных антиоксидантных ферментов ЦНС, нейроны противодействуют вызываемым АФК повреждениям после ишемии головного мозга.

Активность фермента значительно увеличивает жизнеспособность нейронов, понижая внутриклеточный уровень супероксид-радикала [42].

Cu — эссенциальный МЭ, имеющий прямое отношение к процессам клеточного дыхания нейронов, один из ключевых ферментов «дыхательной цепи». Дефицит Cu приводит к развитию анемии [43]. Cu принимает участие в обмене N, входя в состав нитратредуктазного комплекса, участвует в процессах, которые обеспечивают ткани O2.

Cu входит в состав десятков ферментов, задействованных в окислительно-восстановительных реакциях, поддержке состояния соединительной ткани, синтезе нейротрансмиттеров, активации пептидных гормонов, каскаде свертывания крови, всасывании Fe и др.

К наиболее известным Cu-зависимым ферментам относятся цитохром-С-оксидаза (перенос электронов в дыхательной цепи митохондрий) и Cu/Zn-СОД.

Цитохром-С-оксидаза — компонент дыхательной цепи, катализирующей восстановление молекулярного O2 до H2O. В ходе этого процесса перенос электронов и протонов способствует синтезу АТФ.

Электроны переносятся через гем и атом Cu, являющиеся кофакторами цитохром-С-оксидазы.

Падение ее активности (вследствие генетических дефектов или дефицита Cu) приводит к наследственной нейропатии Лебера, идиопатической сидеробластической анемии [44] и миоглобинурии.

Cu, Zn-СОД — ферменты антиоксидантной защиты. К факторам, стимулирующим процесс клеточной гибели, относится O2–, который контактирует с эндотелием и, ингибируя свободный радикал NO, вызывает стойкий вазоспазм. Одним из источников O2– является оксигемоглобин.

Высвобождение O2– также происходит в результате фагоцитоза, который сопровождает апоптоз. Разрушая пероксидный и надпероксидный анионы, СОД наряду с каталазой, обеспечивают защиту от высокореактивных форм кислорода.

Удаляя свободные радикалы, СОД способствуют нормализации процессов воспаления.

Cu, Zn-зависимая СОД 1 способствует повышению антиоксидантной защиты нейронов ЦНС при ИИ. Снижение ее активности ведет к повышению концентрации O2–, повреждению ДНК и активации апоптоза.

Имплантация клеток нейронов-предшественников с повышенной экспрессией Cu, Zn-СОД в область ишемического повреждения уменьшала размер зоны инфаркта и способствовала улучшению неврологических показателей [45].

Se предохраняет митохондрии от оксидативных повреждений и поддерживает биогенез митохондрий. Прием селенита натрия (по 0,2 мг/кг в сутки в течение 7 дней) способствует снижению объема инфаркта и окисления молекул ДНК.

Дотации Se стимулируют увеличение уровней экспрессии двух белков биогенеза митохондрий: коактиватора рецептора активаторов пролиферации пероксисом (PGC-1a) и дыхательного фактора ядра 1 (NRF1) [46]. Дефицит Se увеличивает восприимчивость к глутамат-эксайтотоксичности.

Добавление Se в пределах физиологической нормы к культуре нейронов защищает их от эксайтотоксического повреждения.

Нейропротекторное действие Se напрямую не опосредовано антиоксидантными эффектами самого селенита и требует синтеза антиоксидантных Se-содержа­щих белков (прежде всего глутатионпероксидазы), способствующих ингибированию активируемого глутаматом NF-kappaB — сигнального белка провоспалительных реакций [47].

Достаточный уровень активности ферментов-антиоксидантов принципиально важен для предотвращения нейрональных повреждений при ИИ.

Исследование активности антиоксидантных ферментов в первые часы и дни у пациентов с острым ИИ по сравнению с перенесшими ИИ в течение последних 12 мес показало важную роль Se-зависимой глутатионпероксидазы в антиоксидантной защите ЦНС.

У пациентов с острым ИИ отмечены значительные изменения в активности глутатионовой антиоксидантной системы в первые часы и дни заболевания — уровень глутатиона был значительно повышен в первые часы (р